二、TOPO克隆PCR产物的纯化与回收

1. PCR反应后，需通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定，确认是否存在预期大小的条带。

2. 推荐采用切胶回收法进行纯化，切胶时间应控制在3分钟内，以避免紫外线对DNA的潜在损伤。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，确保浓度≥30ng/μl，并再次通过跑胶验证是否仅存在目标条带。

3. 将目标片段连接至载体时，连接反应体系应按照说明书要求进行，各组分投入体积应≥1μl。如浓度过高，可适当稀释。连接反应的温度可以尝试25°C或37°C，时间设置为5分钟；若出现克隆失败或假阳性，可适当延长至30分钟。

4. 感受态细胞转化与涂板：选择DH5α、Fast-T1等化学感受态细胞用于转化，切忌反复冻融使用，-80°C存储后建议一次性取出使用。重组产物与感受态细胞的比例为1:10，推荐将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞中。

5. 热激时间需遵循感受态细胞说明书的操作要求，确保平板所使用的抗生素与转化载体的抗性一致。菌液涂板的时候，将菌液进行离心（2500×g，3分钟），吸取丢弃多余的LB培养基，保留100μl悬浮液并全部涂板，或吸取适量体积进行涂板。

6. 单克隆菌落PCR鉴定：挑选平板中体积适中的单克隆菌落进行鉴定，避免选择过大或过小的菌落。建议挑取多个单克隆菌落进行分析，将挑取的菌落放入添加了10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解，混匀后取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

针对具有Amp/kana抗性的质粒，需对目的片段进行切胶回收。

人生就是博-尊龙凯时，中科腾宇(广州)科技技术有限公司专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务，努力发展成为基因治疗和细胞治疗的生物科技企业。公司总部位于广州，致力于为全国客户提供最新的专业资讯和全面的产品与物流服务。凭借强大的技术团队和广泛的人脉资源，我们在全国主要城市建立了众多合作伙伴关系，十分荣幸能将世界领先的高科技产品推荐给从事生物学研究的老师和同仁。作为专业的产品供应商，公司储备了大量现货，并配备优秀的销售团队和专业技术支持，随时为客户提供优质服务。